羊肚菌(Morchella)是一種野生珍貴菌,由于 其菌蓋表面凹凸不平,狀如羊肚,故名羊肚菌?羊 肚菌為羊肚菌科盤菌目珍稀的食藥兩用真菌?羊 肚菌肉質(zhì)脆嫩,風(fēng)味獨(dú)特,味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)和藥用 價(jià)值極高?羊肚菌既是宴會(huì)上的佳肴,又 是久負(fù)盛名的良藥,曾經(jīng)作為珍惜貢品獻(xiàn)給皇帝享 用?在我國(guó),有關(guān)羊肚菌的藥用記載始于李時(shí)珍 的《本草綱目》“甘寒無(wú)毒?益腸胃?化氮理氣”? 如今羊肚菌已經(jīng)成為歐洲國(guó)家著名的高級(jí)食材, 含有豐富的蛋白質(zhì)?多種維生素及 20 多 種氨基 酸,味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富?它與冬蟲(chóng)夏草功能相同, 是一種不含任何激素?無(wú)任何副作用的天然滋補(bǔ) 品?羊 肚 菌 春 末 至 秋 初 生 長(zhǎng) 于 海 拔 2000~ 3000m的針葉闊葉混交林中,在云南?四川?西 藏?貴州?遼寧等地有分布。

該研究通過(guò)利用高效毛細(xì)管電泳建立不同來(lái) 源的羊肚菌進(jìn)行指紋圖譜,并結(jié)合相似度評(píng)價(jià)?聚 類分析及主成分分析等方法對(duì)8種羊肚菌樣品進(jìn) 行相關(guān)分類,以期為全面評(píng)價(jià)羊肚菌提供有效方 法和科學(xué)依據(jù)。

供試羊肚菌菌種保存于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所;主要來(lái)源于遼寧?武 漢和四川 (表1),Na2B4O7?H3BO3?Na2HPO4?NaH2PO4 (美國(guó)amresco生物試劑公司);試驗(yàn)過(guò)程用的試 劑均為分析純和色譜純;試驗(yàn)用水為超純水。

供試儀器:P/ACE MDQ 毛細(xì)管電泳儀(美國(guó)貝克曼公司);精密 pH 計(jì)(北京泰亞賽?？萍及l(fā)展有限責(zé)任公司);電子天平(賽多利斯);超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);HZQ-QX 全溫振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電 子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司);干熱消毒箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);A11高速粉碎機(jī)(德國(guó)IKA 集 團(tuán));CascadaTM實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)(Pallcorporation) 微孔濾膜(孔徑0.22μm,津隆設(shè)備有限公司)。

將實(shí)驗(yàn)室保存的羊肚菌活化接種于馬鈴薯液 體培養(yǎng)基中,25 ℃,180r·min-1搖床培養(yǎng)7d? 將發(fā)酵 液 過(guò) 濾 后,用 無(wú) 菌 水 沖 洗 菌 絲 體 3 次, 60 ℃烘干,粉碎,過(guò)100目篩?得到的菌粉按照 1∶30加水,超聲30min,95 ℃水浴鍋保溫4h,過(guò) 濾后取上清液?將處理好的產(chǎn)物用0.22μm 孔 徑的水系濾膜過(guò)濾,收集續(xù)濾液加同體積的運(yùn)行 緩沖液作為樣品溶液。

電泳操作條件如下:未涂層石英毛細(xì)管(50μm×48cm);運(yùn)行緩沖液10mmol·L-1硼 砂緩沖液(pH9.21);10mmol·L-1硼酸緩沖液; 檢測(cè)波長(zhǎng)214nm;分離電壓20kV;溫度 25 ℃;壓力0.5psi進(jìn)樣10s,運(yùn)行時(shí)間為30min?毛細(xì) 管柱用前依次用0.1mol·L-1NaOH 溶液?水? 運(yùn)行緩沖液分別沖洗10min,進(jìn)樣前用運(yùn)行緩沖 液沖洗5min。

方法的精密度:取羊肚菌 LNY4菌粉溶液用 緩沖液配置成0.05mg·mL-1(按照上述色譜條 件)連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次,記錄遷移時(shí)間和峰面積, 計(jì)算遷移時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)和峰面積的相對(duì) 標(biāo)準(zhǔn)差 (RSD)均 小 于 3%,表 明 儀 器 的 精 密 度 良好? 穩(wěn)定性的測(cè)定:將羊肚菌 LNY4菌粉提取好 的樣品(按照上述的方法制得),分別在室溫下放 置0?2?4?6?8h后(按照上述的色譜條件)分別進(jìn) 樣,計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的 RSD<1%, 相對(duì)峰面積的 RSD<3%,表明樣品在8h內(nèi)各成 分穩(wěn)定? 重現(xiàn)性試驗(yàn):取羊肚菌 LNY4菌粉(按照上 述的方法制得),同法制備7 個(gè)供試品進(jìn)行檢測(cè), 記錄和計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的 RSD均小于3%,表明該方法的重現(xiàn)性好? 方法準(zhǔn)確性驗(yàn)證:為驗(yàn)證該研究的可靠性和 準(zhǔn)確性,將8種羊肚菌樣品進(jìn)行 DNA 的提取,并 建立 分 子 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹(shù)?2 條 PCR 引 物 分 別 為 ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)? PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 預(yù)變性4min,95 ℃ 變性30s,57℃退火30s,72℃延伸60s,30個(gè)循 環(huán),72 ℃延伸7min? 1.3 數(shù)據(jù)分析 對(duì)獲得的8種羊肚菌指紋圖譜采用 Excel和 SPSS軟件中的相似度評(píng)價(jià)?聚類分析和主成分 分析等方法進(jìn)行分析或作圖?為確定羊肚菌毛細(xì) 管電 泳 圖 譜 的 特 征 峰 和 共 有 指 紋 圖 譜;利 用 Mega7.0軟件的 NJ法建立8種羊肚菌的分子系 統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

制定指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)常使用參比物,以確定圖譜中參照峰的位置和豐度?一般情況下參比 物選取容易獲取一個(gè)或一個(gè)以上的主要活性物 質(zhì),主要用于考察指紋圖譜的穩(wěn)定程度和重現(xiàn)性, 該研究選取了重現(xiàn)率為100%,且分別在8個(gè)樣 品中峰面積最高占比為19.82%~29.06%的10 號(hào)峰為參比物。

一個(gè)品種的指紋圖譜是由各個(gè)具有指紋意義的峰組成的完整圖譜構(gòu)成,各個(gè)有指紋意義的峰 的位置(保留時(shí)間)?大小或高低(相對(duì)面積或峰 高)?各峰之間相對(duì)的比例是指紋圖譜的綜合參數(shù)?供試品與對(duì)照樣品之間的相對(duì)峰面積積分相 差20%以上的,說(shuō)明樣品含有的內(nèi)在物質(zhì)有較為 明顯“量”的差異?在相同色譜條件下對(duì)8種羊肚 菌樣品進(jìn)行測(cè)試,以 10號(hào)峰為參照峰,計(jì)算其它 各峰 的 相 對(duì) 保 留 時(shí) 間 (表 2)和相對(duì)峰面積。

為選取適當(dāng)?shù)臋z測(cè)波長(zhǎng),采用二極管檢測(cè)器 對(duì)樣品溶液在波長(zhǎng)為190~300nm 范圍內(nèi)進(jìn)行 掃描,發(fā)現(xiàn)樣品在214nm 處能夠同時(shí)出峰且分 離效果較好,故選取此波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)?試驗(yàn) 常用的磷酸鹽?硼砂等緩沖體系對(duì)樣品及對(duì)照品 的分離進(jìn)行考察,以 選 取 合 適 的 緩 沖 體 系? 通 過(guò)磷酸鹽 緩 沖 液 不 同 的 pH,確 定 分 離 樣 品 的 最適 分 離 pH,通 過(guò) 試 驗(yàn) 比 較 發(fā) 現(xiàn),用 pH 為 9.21的磷酸鹽溶液分離時(shí),樣品的分離效果較 好,故選擇堿性緩 沖 液 硼 砂 溶 液 進(jìn) 一 步 進(jìn) 行 優(yōu)化?選擇 10?20?50?75mmol·L-1硼砂緩沖液 對(duì)樣品進(jìn)行分離?結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)硼砂緩沖液濃度達(dá) 到10mmol·L-1時(shí),樣品和對(duì)照品的分離效果最 佳,分離度和峰形都達(dá)到了相對(duì)最好的情況,故選 10mmol·L-1及pH 為9.21的硼砂,10mmol·L-1 硼酸緩沖液緩沖體系作為最終運(yùn)行緩沖液?并在 此條件下進(jìn)行波長(zhǎng)優(yōu)化及電壓優(yōu)化?在優(yōu)化分離 電壓時(shí),比較分析15?20?30kV3個(gè)不同電壓下 樣品的遷移與分離情況,發(fā)現(xiàn)在15kV 時(shí),基線 不好,30kV 時(shí)出峰延遲,峰形拖尾,故最終選擇 20kV 作為電泳測(cè)定的運(yùn)行電壓。