棉花爛鈴病是一類(lèi)由真菌或細(xì)菌引起的棉鈴病 害，包括疫病、紅腐病、炭疽病、黑果病、紅粉病、角斑 病、軟腐病、曲霉病、灰霉病和黑斑病等10余種（過(guò) 崇儉和羅張，1963；棉花鈴病聯(lián)合調(diào)查組，1986）。棉 鈴疫病是我國(guó)各主要產(chǎn)棉區(qū)棉花鈴期的主要病害， 其發(fā)病率和危害性居各種爛鈴病之首（沈其益， 1992；李社增等，2017），嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和 品質(zhì)。

供試病原菌、菌株和植物：棉鈴疫病病原菌菌株 JP5-1，自河北省滄州市獻(xiàn)縣河城街鎮(zhèn)河城街村罹病 棉鈴上分離，在棉鈴上表現(xiàn)為強(qiáng)致病力，由河北省農(nóng) 林科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害生物防治實(shí)驗(yàn)室 保存。在河北省邯鄲市、邢臺(tái)市棉田，辛集市玉米 田，定興縣番茄田和保定市黃瓜田分別采集作物根 圍土壤，采用常規(guī)系列稀釋法共分離純化獲得1 250株 供試細(xì)菌菌株。采用實(shí)驗(yàn)室通用編號(hào)規(guī)則對(duì)其進(jìn)行 編 號(hào) 并 于 - 80℃ 保 存 ，其 中 菌 株 HMB13496~ HMB13542、HMB15830~HMB15869、HMB20800~ HMB20868 和 HMB21265~HMB21493 共 385 株，自 棉花根圍土壤分離；菌株HMB21962~HMB22278和 HMB22870~HMB22926 共 374 株，自玉米根圍土壤 分離；菌株 HMB23318~HMB23448 和 HMB23606~ HMB23784 共 310 株，自番茄根圍土壤分離；菌株 HMB23807~HMB23987 共 181 株，自黃瓜根圍土壤 分離。在棉花盛鈴期，從河北省保定市高陽(yáng)縣邢家 南鎮(zhèn)北于八村試驗(yàn)棉田采集帶柄、健康、直徑約2.5 cm 的成鈴，備用。棉花品種為農(nóng)大棉8號(hào)。 培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：20% 土豆煎汁、2% 葡萄糖、2% 瓊脂粉、蒸餾水1 000 mL；LB（Luria-Bertani）固體培 養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、1% NaCl、2%瓊脂 粉、蒸餾水1 000 mL；LB液體培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨、 0.5%酵母粉、1% NaCl、蒸餾水1 000 mL。 藥劑、試劑及儀器：80%三乙膦酸鋁（phosethylAl）可濕性粉劑，浙江嘉華化工有限公司。細(xì)菌基因 組 DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公 司；PCR擴(kuò)增試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒， 寶生物工程（大連）有限公司；rTaq酶、10×PCR Buffer、dNTP Mix ，寶生物工程（大連）有限公司；自制 的結(jié)晶紫染色液，將結(jié)晶紫2 g溶于20 mL 95%乙醇 中，取20 mL與1%草酸銨水溶液80 mL混勻置24 h 后過(guò)濾；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。BX63F正置熒 光顯微鏡，日本Olympus公司；2720型PCR儀，德國(guó) Biometra 公司；DYY-6C 電泳儀，北京六一儀器廠； GEN III-Omnilog型Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)，美 國(guó) Biolog 公司；上海精宏SHP-080生化培養(yǎng)箱；ZQZY-80BS振蕩培養(yǎng)箱， 上海知楚儀器有限公司；VD-650-U潔凈工作臺(tái)，蘇 州安泰空氣技術(shù)有限公司。

采用平板對(duì)峙法（李社增等，2005b）測(cè)定1 250株 供試菌株對(duì)苧麻疫霉的拮抗作用。將4℃下保存的 苧麻疫霉轉(zhuǎn)接到PDA平板上，于25℃下培養(yǎng)3 d，在 苧麻疫霉菌落邊緣用直徑 6 mm 打孔器打取菌餅， 將苧麻疫霉菌餅轉(zhuǎn)接到另一個(gè)PDA平板中央，將活 化后的供試細(xì)菌菌株在距苧麻疫霉菌餅 20 mm 處 點(diǎn)接接種，以不接種任何供試細(xì)菌菌株的苧麻疫霉 為空白對(duì)照。25℃恒溫培養(yǎng)5 d后，測(cè)量苧麻疫霉正 常生長(zhǎng)半徑、抑制生長(zhǎng)半徑和抑菌帶，計(jì)算抑菌率， 抑菌率=（正常生長(zhǎng)半徑-抑制生長(zhǎng)半徑）/正常生長(zhǎng) 半徑×100%。以抑菌帶和抑菌率為指標(biāo)初步篩選對(duì) 苧麻疫霉有較好拮抗作用的供試菌株。 將-80℃下保存的苧麻疫霉拮抗菌菌株轉(zhuǎn)接到 LB固體培養(yǎng)基試管斜面上活化，24 h后挑取單菌落 接入裝有 100 mL LB 液體培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶 中，在振蕩培養(yǎng)箱中于 170 r/min、30℃條件下培養(yǎng) 48 h，用 LB 固體平板培養(yǎng)基檢測(cè)培養(yǎng)液中菌體數(shù) 量，用無(wú)菌 0.9% 生理鹽水將其調(diào)配成濃度為 1.0× 107 CFU/mL的細(xì)菌培養(yǎng)液。

稱取1 g 80%三乙膦酸鋁可濕性粉劑，放入1 L 的玻璃量杯中，加入100 mL無(wú)菌水，玻璃棒攪拌使 之溶解，再加入400 mL無(wú)菌水即配制成80%三乙膦 酸鋁可濕性粉劑500倍藥液。 對(duì)初步篩選的供試菌株進(jìn)行室內(nèi)篩選。采用離 體棉鈴人工接種病原菌。將田間采集的健康帶柄棉 鈴用75%酒精進(jìn)行表面滅菌，并將棉鈴固定在長(zhǎng)40 cm、 寬25 cm的長(zhǎng)方形白色泡沫板上，室溫下晾干。每 塊泡沫板平均分為8列，每列平均固定5個(gè)棉鈴，共 40個(gè)棉鈴，每2 列的10個(gè)棉鈴為1個(gè)處理的1次重 復(fù)。在每個(gè)棉鈴表面噴施濃度為 1.0×107 CFU/mL 供試拮抗細(xì)菌培養(yǎng)液1 mL，以每個(gè)棉鈴噴施80%三 乙膦酸鋁可濕性粉劑500倍藥液1 mL為化學(xué)藥劑對(duì) 照，噴施等量蒸餾水為空白對(duì)照，噴施不同處理藥劑 時(shí)用擋板將其它棉鈴隔開(kāi)，保證藥液噴施在10個(gè)目 的棉鈴表面，每個(gè)處理重復(fù)4次。將固定有40個(gè)棉 鈴的泡沫板放入盛有 300 mL 無(wú)菌水、長(zhǎng)´寬´高為 42.0 cm´27.5 cm´10.5 cm 的保濕培養(yǎng)盒內(nèi)，用保鮮 膜封嚴(yán)保濕，置于25℃人工氣候室恒溫培養(yǎng)。24 h 后打開(kāi)保濕培養(yǎng)盒，在每個(gè)棉鈴鈴縫中上部用消毒 針刺 3 個(gè)小孔，深度 3 mm，將在 PDA 培養(yǎng)基上于 25℃培養(yǎng)5 d的苧麻疫霉菌落用打孔器打取直徑為6 mm的菌餅，貼接在棉鈴鈴縫針孔處，繼續(xù)保濕培養(yǎng)。

1 250 株作物根圍細(xì)菌中共篩選到 399 株對(duì) 苧麻疫霉有較好拮抗作用的供試菌株，其中抑菌帶大于等于 9.0 mm 的菌株有 40 株，抑菌帶大于等于 10.0 mm 的 菌 株 有 11 株 ，抑 菌 率 達(dá) 到 80.00%~ 85.71%，其中菌株 HMB22922 對(duì)苧麻疫霉抑 菌率最高，為85.71%，抑菌帶寬10.0 mm。對(duì)初步篩選的 11 株供試菌株進(jìn)行室內(nèi)篩選。 人工接種病原菌后，棉鈴疫病發(fā)病迅速，其中10株 供試菌株對(duì)棉鈴疫病表現(xiàn)一定的防治效果。 接種后5 d時(shí)，空白對(duì)照的病情指數(shù)達(dá)到14.38，噴施 菌株HMB22922、菌株HMB23917、菌株HMB21405 細(xì)菌培養(yǎng)液棉鈴的病情指數(shù)和化學(xué)藥劑之間差異不 顯著，但均顯著低于空白對(duì)照（P<0.05），防治效果分別達(dá)到 73.92%、69.58%、56.54% 和 70.72%；噴施其 它7株菌株細(xì)菌培養(yǎng)液棉鈴的病情指數(shù)與空白對(duì)照 之間差異不顯著。接種7 d后，空白對(duì)照病情指數(shù)為46.88，噴施菌 株HMB22922、菌株HMB21405、菌株HMB23917細(xì) 菌培養(yǎng)液棉鈴的病情指數(shù)和化學(xué)對(duì)照藥劑之間差異 仍然不顯著，但均顯著低于空白對(duì)照（P<0.05），對(duì)棉 鈴疫病的防治效果分別為 81.34%、66.67%、64.60% 和 71.11%；噴施菌株 HMB23319、菌株 HMB22277、 菌株 HMB20802 和菌株 HMB23707 細(xì)菌培養(yǎng)液棉 鈴的病情指數(shù)顯著低于空白對(duì)照（P<0.05），對(duì)棉鈴 疫病的防治效果在34.67%~49.34%之間；噴施菌株 HMB20803、菌株 HMB20826 和菌株 HMB23663 細(xì) 菌培養(yǎng)液棉鈴的病情指數(shù)與空白對(duì)照之間差異不顯 著，對(duì)棉鈴疫病的防治效果在20.01%~29.34%之間。

拮抗作用是生防細(xì)菌發(fā)揮生物防治效果的主要 機(jī)制之一，通過(guò)拮抗活性測(cè)定初步篩選生防細(xì)菌是 目前最普遍的方法（張斌等，2015）。由于棉鈴疫病 的主要病原菌苧麻疫霉可以離體培養(yǎng)，本研究采用 對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行棉鈴疫病生防細(xì)菌的初步篩選，共獲得11株拮抗活性較強(qiáng)的拮抗細(xì)菌。然而眾多研 究表明，離體拮抗活性較強(qiáng)的細(xì)菌在田間未必表現(xiàn) 出較好的生物防治效果（劉郵洲等，2012），因?yàn)橛行?細(xì)菌抑菌物質(zhì)的產(chǎn)生受培養(yǎng)條件的影響，在PDA培 養(yǎng)基上可以產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)，但在棉鈴上未必產(chǎn)生 或產(chǎn)生的濃度不足以抑制病原菌。另外，防治效果較好的生防細(xì)菌往往是多個(gè)生防作用機(jī)理綜合表現(xiàn) 的結(jié)果，包括抑菌作用（Kumar et al.，2011）、競(jìng)爭(zhēng)作 用（Yánez-Mendizábal et al.，2012）以及誘導(dǎo)植物抗 病性（Kloepper et al.，2004；Lahlali et al.，2013）等。 本研究針對(duì)初步篩選的11株拮抗細(xì)菌進(jìn)行了離體 防治效果和田間防治效果評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)只有拮抗細(xì)菌 HMB22922在田間表現(xiàn)出較好的防治效果。本研究 已明確 HMB22922 菌株對(duì)苧麻疫霉有很好的抑菌 作用，該菌株對(duì)苧麻疫霉是否產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用，對(duì)棉花 植株是否產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性作用仍需深入研究。

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