２型糖尿?。ǎ裕穑澹玻洌椋幔猓澹簦澹螅恚澹欤欤椋簦酰?，Ｔ２ＤＭ） 是遺傳和環(huán)境等多種因素聯(lián)合作用而導(dǎo)致的胰島素 抵抗（Ｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＩＲ）與胰島素相對分泌不 足，致使葡萄糖、氨基酸及脂質(zhì)代謝綜合紊亂的一種 全身慢性代謝性疾病。據(jù)２０１７年ＪＡＭＡ 發(fā)表的研 究文章顯示，中國糖尿病患病率為１０．９％，糖尿病 前期約為 ３５．７％。糖尿病患者全球 已 逾１．７億，其 中２型糖尿病占９０％左右，目前發(fā)病率呈逐年上升 趨勢，已經(jīng)成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三位主要非傳染性疾病。

１ 材料

１．１ 動物

ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪｄｂ／ｄｂ２型糖尿病模型小鼠 ６只，６周齡雄 雌 各 半，其 對 照ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪｄｂ／ｍ 小鼠６只，６周齡雄雌各半（購自江蘇南京鵬晟生物科技發(fā)展有限公司），飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué) ＳＰＦ 級 動 物實(shí)驗(yàn)中心。

１．２ 主要試劑

ＱＩＡａｍｐＤＮＡＳｔｏｏｌＭｉｎｉＫｉｔ試 劑盒（德國 Ｑｉａｇｅｎ公司），ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲｋｉｔ（德 國 Ｑｉａｇｅｎ公司），５０ｂｐＭａｒｋｅｒ（北京博邁德科技發(fā)展有限公司），溴乙靛（天根生化科技），瓊脂糖凝膠 ＤＮＡ 回收試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）， 胰高血糖素樣 肽１（ＧＬＰ－１）、Ｃ 肽（Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ）酶 聯(lián) 免疫測定試劑盒（上海研輝生物有限公司）。

１．３ 主 要 儀 器

血 糖 儀 （羅 氏 ），凝 膠 成 像 儀 （ＡＩｐｈａＩｍａｇｅｒＨＰ），電 泳 儀、全 自 動 酶 標(biāo) 儀、ＰＣＲ 擴(kuò)增儀、實(shí)時(shí)熒光定量儀（美國 Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司），低速 大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），電熱恒 溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司），組織勻漿儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），厭 氧 罐 及 厭 氧 袋 （日本三菱）。

２ 方法

２．１ 樣本采集及處理

２．１．１ 動物分組及糞樣的收集

６周齡ｄｂ／ｄｂ２型 糖尿病模型小鼠和對照組ｄｂ／ｍ 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)１ 周后，開始監(jiān)測小 鼠（７－１２周）的 體 質(zhì) 量 和 空 腹 血 糖（ＦＢＧ），收集每天下午４∶００－５∶００的新鮮糞樣 于凍存管中密封，迅速液氮冷凍后放入?yún)捬醮校D(zhuǎn) 存至－８０℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br />
２．１．２ 血樣

實(shí)驗(yàn)終末期用乙醚將小鼠麻醉后剖開腹部，收集門脈血及腹 主 靜 脈 血，３０００ｒ／ｍｉｎ離 心１５ｍｉｎ后分離血清，迅速放入液氮冷凍后，轉(zhuǎn)存 至－８０℃冰箱保存?zhèn)溆谩?２．１．３ 組織 小鼠處死后，收集結(jié)腸部位的內(nèi)容物 及結(jié)腸組織，迅速液氮冷凍后，轉(zhuǎn)存至－８０℃冰箱保 存?zhèn)溆谩?br />
２．２ 腸道多形擬桿菌、史氏產(chǎn)甲烷短桿菌的檢測

２．２．１ 結(jié) 腸 內(nèi) 容 物 和 糞 樣 腸 道 微 生 物 總 ＤＮＡ 提 取

按照 ＱＩＡａｍｐＤＮＡＳｔｏｏｌＭｉｎｉＫｉｔ試劑盒（德 國 Ｑｉａｇｅｎ公司）的使用說明提取結(jié)腸內(nèi)容物和糞樣 中的細(xì)菌總 ＤＮＡ。

２．２．２ 總 ＤＮＡ 濃度測定及純度鑒定

以 ＴＥ 對照 液，?。?mu;ＬＤＮＡ 樣品，ＤａｎｏＤｒｏｐ１０００測定總 ＤＮＡ 在２６０ｎｍ 和 ２８０ｎｍ 處 的 吸 光 度。 取 ５μＬ 總 ＤＮＡ 和２μＬｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ電泳經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳，８０Ｖ 電 壓４０ ｍｉｎ，凝 膠 成 像 儀 照 像，檢 測 總 ＤＮＡ 的純度與完整性。

２．２．３ 多形擬 桿 菌、史 氏 產(chǎn) 甲 烷 短 桿 菌

１６ＳｒＲＮＡ Ｖ６區(qū) ＰＣＲ擴(kuò)增 在１６ＳｒＲＮＡ Ｖ６可變序列區(qū)進(jìn) 行細(xì)菌特異性引物的設(shè)計(jì)，用于引導(dǎo)１６ＳｒＲＮＡ Ｖ６ 可變區(qū)的 ＰＣＲ擴(kuò)增反應(yīng)，序列見表１。

２．２．３．１ 普 通 ＰＣＲ 體系和反應(yīng)程序

反 應(yīng) 體 系 （２０μＬ）：２×ＰＣＲ ｍｉｘ１０μＬ，上、下游引物（表１）各 ０．５ μＬ，細(xì) 菌 總 ＤＮＡ ２ μＬ，Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ－ｗａｔｅ ７μＬ。反應(yīng) 程 序：預(yù) 變 性 ９５℃、３ ｍｉｎ；變 性 ９５℃、 ３０ｓ，退火（表１）、３０ｓ，延伸７２℃、１ｍｉｎ，共３９個(gè)循 環(huán)；終延伸７２℃、５ｍｉｎ，４℃保持。

２．２．３．２ ＰＣＲ產(chǎn)物鑒定

ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)２．５％瓊脂糖 凝膠電泳，８０ Ｖ 電 壓 ４０ ｍｉｎ，凝膠成像儀下觀察 結(jié)果。

２．２．３．３ 多形擬桿菌、史氏產(chǎn)甲烷短桿菌

ＲＴ－ｑＰＣＲ 檢測

２．２．３．３．１ 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將多形擬桿菌、史氏 產(chǎn)甲烷 短 桿 菌 的 ＰＣＲ 產(chǎn) 物 經(jīng) 切 膠、回 收 后 作 為 ＤＮＡ 標(biāo)準(zhǔn)品，將 標(biāo) 準(zhǔn) 品 稀 釋 為 濃 度 梯 度 為 １０１ ～ １０８ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ的 ＤＮＡ 樣本作為陽性模板，同 時(shí) 以 Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒ?yàn)殛幮?對 照，每 個(gè) 樣 平 行 重 復(fù) ３次，反應(yīng)體系（２０μＬ）：上、下游引物各０．５μＬ，熒 光染料（ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ）１０μＬ，ＤＮＡ 模板２μＬ，Ｎｕ－ ｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ－ｗａｔｅｒ７μＬ，反 應(yīng) 程 序：預(yù) 變 性 ９５℃、 ２ｍｉｎ，變性９５℃、５ｓ，退火（表１）、３０ｓ，３５個(gè)循環(huán)。 由實(shí)時(shí)熒光定量 ＰＣＲ儀自動繪制擴(kuò)增曲線、熔鏈曲 線，產(chǎn) 物 通 過 熔 鏈 曲 線 證 實(shí)。反 應(yīng) 結(jié) 束 后 用 ＰＣＲ 儀附帶軟件分析，自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

２．２．３．３．２ 小鼠糞樣及結(jié)腸內(nèi)容物多形擬桿菌、史 氏產(chǎn)甲烷短桿菌的檢測

按上述“２．２．３．３．１”中的反 應(yīng)體系和程序進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 ＰＣＲ反應(yīng)，檢測小 鼠糞樣及結(jié)腸內(nèi)容物中的多形擬桿菌、史氏產(chǎn)甲烷 短桿菌。 ２．３ ＧＬＰ－１的檢測 酶聯(lián)免疫法（ＥＬＩＳＡ）檢 測 門 脈血、結(jié)腸勻 漿 液 中 ＧＬＰ－１的 含 量：按 照 試 劑 盒 的 使用說明進(jìn)行操作。

２．４ 檢 測 空 腹 Ｃ 肽 水 平

計(jì)算胰島素抵抗指數(shù) （ＨＯＭＡ－ＩＲ）、分 泌 指 數(shù)（ＨＯＭＡ－ＩＳ） 空 腹 Ｃ 肽 采 用 ＥＬＩＳＡ 法檢 測，按照試劑盒的使用說明進(jìn)行操 作。用空腹 Ｃ肽代替胰島素采用改良 ＨＯＭＡ（ＣＰ） 公式評價(jià)胰島素抵抗和胰島素的分泌指數(shù)。

３ 結(jié)果

結(jié)腸內(nèi)容物中史氏產(chǎn)甲烷短桿菌 ＲＴ－ＰＣＲ 結(jié) 果顯示：與對照ｄｂ／ｍ 組小鼠相比，ｄｂ／ｄｂ組小鼠結(jié) 腸內(nèi)容物史氏產(chǎn)甲烷短桿菌數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義 （Ｐ ＜０．０５）。Ｐｅａｒｓｏｎ相 關(guān) 性 分 析 顯 示，腸 道 史 氏產(chǎn)甲烷短桿菌的數(shù)量與小鼠體質(zhì)量 （ｒ＝０．５９，Ｐ ＜０．０１）、空腹血 糖（ｒ＝０．５０，Ｐ ＜０．０１）呈 正 性 相 關(guān)，見圖１１；與小鼠空腹Ｃ肽水平 （ｒ＝－０．４４，Ｐ ＜０．０１）、胰島分泌指數(shù)（ｒ＝－０．３９，Ｐ ＜０．０１）呈負(fù)性 相關(guān)，與胰島素抵抗指數(shù)（ｒ＝０．４９，Ｐ ＜０．０１）呈正 性相關(guān)。

４ 討論

近期越來越多的研究表明腸道微生態(tài)與２型糖 尿病的發(fā) 生、發(fā) 展 密 切 相 關(guān)。Ｎａｄｊａ等通 過 與 正 常青年人群相比，２型糖尿病青年人群腸道中的 多 形擬桿菌門／厚壁菌門比例較高，多形擬桿菌與血糖 呈正相關(guān)。Ｏｌｌｉ等的研究證實(shí)大量的腸道擬桿 菌可以影響實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量。這種作用可能是通過 改變腸道微生物群的組成或通過微生物代謝物介導(dǎo)的。



 

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