資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性清潔級(jí)ＳＤ 大鼠８０只，鼠齡３～４個(gè)月， 體質(zhì)量２３０～２７０ｇ，由西安交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 提供，許可證號(hào)ＳＣＸＫ（陜）２０１２－００３。

二、主要儀器與試劑

主 要 儀 器 包 括 Ｋｅｎｄｒｏ 低 溫 高 速 離 心 機(jī) （德 國(guó) Ｓｏｒｖａｌｌ公司）、ＤＹＮＥＸ ＭＲＸⅡ型酶標(biāo)儀（日本 Ｄｙｎｅｘ 公司）、Ｏｌｙｍｐｕｓ光 學(xué) 顯 微 鏡（日 本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公 司）、 ＲＭ６２４０Ｂ多通道 生 理 信 號(hào) 采 集 處 理 系 統(tǒng)（成 都 儀 器 廠）、ＹＰ１００ 型 壓 力 換 能 器 （成 都 儀 器 廠 ）、 ＳＨＨＷＺＩＣＹ４２０型電熱恒溫水浴箱（北京長(zhǎng)安科學(xué)儀 器廠）、精宏DHG-9023A型 電 熱 恒 溫 鼓 風(fēng) 干 燥 機(jī)（上 海 精 宏公司）、ＤＹＹ－８ 型 穩(wěn) 壓 穩(wěn) 流 電 泳 儀 （上 海 琪 特）、 Ｋａｄｏｋ ＤＣｓ－１２０ 凝 膠 圖 像 分 析 系 統(tǒng) （美 國(guó) Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司）等。主要試劑包括雷帕霉素（華北 制 藥 股 份 有 限 公 司，國(guó) 藥 準(zhǔn) 字 Ｈ２０１０００７９），Ｅ－ ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 等 抗 體 均 購(gòu) 自美國(guó)ＳａｎｔａＣｒｕｚ公 司，四 氯 化 碳 油 溶 液、組 織 細(xì) 胞 裂解液、ＥＣＬ 發(fā) 光 增 強(qiáng) 劑、兔 二 抗 工 作 液、ＤＡＢ 顯 色 劑等均購(gòu)自美國(guó) ＰＩＥＲＣＥ公司。

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）纖維 化 動(dòng) 物 模 型 制 作 及 用 藥 取 健 康 雄 性 清潔級(jí)ＳＤ大鼠３２只，依據(jù)３ｍＬ／ｋｇ體質(zhì)量皮下注射 四氯化碳油溶液４０ｍｌ／Ｌ，２次／周，持續(xù)８周，制備四 氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型。其中，雷帕霉素干預(yù) 組于第６周同時(shí)按２ｍｇ／ｋｇ體質(zhì)量行雷帕霉素灌胃 處理，１次／ｄ，維持２周。另取１６只大鼠納為正常組。 所有大鼠均于第８周處死。
（二）標(biāo)本獲 取 及 保 存 （１）肝 臟 組 織 標(biāo) 本：既 定 時(shí)間 點(diǎn) 處 死 大 鼠，開(kāi) 腹 后 于 腹 主 動(dòng) 脈 取 血，完 整 切 離 肝臟，分別于各肝葉處取一塊肝臟（厚約４ｍｍ），甲醛固定、常 規(guī) 脫 水、石 蠟 包 埋 處 理 后 將 剩 余 肝 臟 組 織 切 塊，置入凍存管 中，于液氮條件下保存；（２）肝 細(xì) 胞 提 ?。阂栽患芋w外循環(huán)膠原酶灌注ｐｅｒｃｏｌｌ密度梯度離 心法，行大鼠肝細(xì)胞分離。大鼠腹腔打開(kāi)后經(jīng)門靜脈 插管，注 入 肝 素 鈉 抗 凝，５０ｍＬ 注 射 劑 緩 慢 灌 注 無(wú) 鈣 Ｄ－ＨＡＮＫＳ液。沖洗肝臟，干凈后０．０５％膠原酶液行 肝臟原位灌注，速度１０ｍＬ／ｍｉｎ，２ｍｉｎ后行肝上下腔 靜脈 結(jié) 扎，將 肝 臟 取 出，行 膠 原 酶 液 灌 注 至 肝 組 織 變 軟、蒼白。肝臟抖動(dòng)并鈍性分離細(xì)胞，２００鉑不銹鋼篩 網(wǎng)過(guò)濾后洗滌，離心處理后獲取肝細(xì)胞，置入凍存管， 于液氮罐凍存?zhèn)溆谩?br /> （三）肝臟組 織 ＨＥ 染 色 （１）肝 臟 組 織 切 片：切 片前將包埋好的標(biāo)本置入－２０ ℃冰 箱 冷 凍３０ ｍｉｎ。 切片厚度３～５μｍ，于普通載玻片上粘附后于６０℃條 件下烘烤，６０ｍｉｎ后取出裝盒；（２）ＨＥ染色：石蠟切片 脫蠟至水，經(jīng) ＰＢＳ沖 洗、蘇 木 青 染 色、鹽 酸 酒 精 分 化、 ＰＢＳ漂洗等處理后晾干后中性樹(shù)膠封片，鏡檢。
（四）肝臟組 織 中 α－ＳＭＡ 表 達(dá) 檢 測(cè) （１）載 玻 片 及蓋 玻 片 處 理、切 片：載 玻 片 洗 凈 后 置 入 多 聚 賴 氨 酸 溶液（經(jīng)１∶１０去離子水稀釋）中，浸泡５ｍｉｎ后烘烤 裝盒。切片于載玻片上粘附后烘烤裝盒；（２）免 疫 組 化：石蠟切片脫 蠟 至 水，經(jīng) ＰＢＳ沖 洗、浸 泡、滴 加 二 抗 工作 液、蘇木素復(fù)染等處理后中性樹(shù)膠封 片，鏡 檢。 采用免疫組化檢測(cè)肝組織中α－ＳＭＡ 表達(dá)。
（五）蛋白 表 達(dá) 檢 測(cè) 將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞用細(xì) 胞 刷刮下后，經(jīng)勻漿、Ｓ－ＰＡＧＥ膠制備、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、 封閉、結(jié)合一抗、洗滌、曝光顯影、定影 ＨＲＰ－ＥＣＬ發(fā)光 處理后，運(yùn)用 Ｅｐｓｏｎ彩色圖像掃描儀獲取蛋白質(zhì)信號(hào) 條帶圖像。采用 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ測(cè)定蛋白表達(dá)。 四、觀察指標(biāo) 分析三組肝 臟 組 織α－ＳＭＡ 染 色、ＨＥ 染 色 結(jié) 果， 對(duì)比 三 組 Ｅ－ｃａｄｅｈｅｒｉｎ、ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 表 達(dá)，并觀察三組上皮間質(zhì) 轉(zhuǎn)化通路重要蛋白 ｐ－ ｓｍａｄ２、ｐ－ｓｍａｄ３、ｓｍａｄ２／３、ｓｍａｄ４表達(dá)，探討雷帕霉素 抑制肝纖維化進(jìn)程中肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制。 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用ＳＰＳＳ１９．０ 軟 件 處 理 數(shù) 據(jù)。以 百 分 率（％） 表示計(jì)數(shù)資料，組間行χ ２ 檢驗(yàn)；以（ｘ珔±ｓ）表示計(jì)量資料，組間行ｔ值檢驗(yàn)。Ｐ＜０．０５為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

成功建立四氯化碳誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，模型 對(duì)照組和雷帕霉素干預(yù)組在８周時(shí)各有１只死亡，均 經(jīng)α－ＳＭＡ 組化、ＨＥ染色證實(shí)。經(jīng) ＨＥ染色發(fā)現(xiàn)雷帕 霉素干預(yù) 組 肝 纖 維 化 顯 著 減 輕，經(jīng) 免 疫 組 化 行 經(jīng) α－ ＳＭＡ 再次驗(yàn)證。模型對(duì)照組 肝 臟 中 肝 細(xì) 胞 內(nèi)Ⅰ型膠原表達(dá)較正 常組明顯增 高（Ｐ＜０．０５），上 皮 標(biāo) 志 物 Ｅ－ｃａｄｅｈｅｒｉｎ、 ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３表達(dá)較正常組明顯減少（Ｐ＜０．０５），間 質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志 Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 表達(dá)較正常組明顯增高 （Ｐ＜０．０５），上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路重要蛋白 ｐ－ｓｍａｄ２、ｐ－ ｓｍａｄ３、ｓｍａｄ２／３、ｓｍａｄ４ 較 正 常 組 明 顯 增 高 （Ｐ ＜ ０．０５）。雷帕霉素干預(yù)組肝臟內(nèi)肝細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá) 及 Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 表 達(dá) 較 模 型 對(duì) 照 組 顯 著 下 降（Ｐ ＜０．０５），肝細(xì)胞 Ｅ－ｃａｄｅｈｅｒｉｎ、ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３表達(dá)較模型 對(duì) 照 組 明 顯 增 高 （Ｐ ＜０．０５），ｐ－ｓｍａｄ２、ｐ－ｓｍａｄ３、 ｓｍａｄ２／３、ｓｍａｄ４表達(dá)較模型對(duì)照組顯著下降 （Ｐ＜ ０．０５）。

討　　論

近年來(lái)有研究表明，肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與肝纖 維化有關(guān)。Ｎｉｓｈｉｋａｗａ等采用 ＴＧＦ－β１處理體外 培養(yǎng)所致大鼠成熟肝細(xì)胞，發(fā) 現(xiàn) 肝 細(xì) 胞 經(jīng) ＴＧＦ－β１處 理后 白 蛋 白 表 達(dá) 明 顯 下 降，Ⅰ 型 膠 原 表 達(dá) 上 升；而 ＴＧＦ－β１處理后尚存活肝細(xì)胞伴上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，推 測(cè) 肝纖維化 中 肝 細(xì) 胞 上 皮 間 質(zhì) 轉(zhuǎn) 化 起 著 重 要 作 用。王 川林等發(fā)現(xiàn)，肝纖維化中纖維組織母細(xì)胞部分源于 成熟肝細(xì) 胞。四 氯 化 碳 誘 導(dǎo) 大 鼠 肝 纖 維 化 模 型 屬 接 近肝炎肝纖維化模型。本研究經(jīng)建立該模型發(fā)現(xiàn)，大 鼠肝纖維化過(guò)程中成熟肝細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，Ｅ－ ｃａｄｅｈｅｒｉｎ、ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３表 達(dá) 明 顯 減 少，間 質(zhì) 細(xì) 胞 標(biāo) 志 Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α－ＳＭＡ 表達(dá)明 顯 增 高，且發(fā)現(xiàn)這類肝細(xì)胞 分泌Ⅰ型膠原增多，預(yù)示肝纖維化過(guò)程中肝細(xì)胞上皮 間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞內(nèi)上 皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通路重要蛋白ｐ－ｓｍａｄ２、ｐ－ｓｍａｄ３、ｓｍａｄ２／ ３、ｓｍａｄ４明顯增高，進(jìn)一步證實(shí)肝細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 參與肝纖維化過(guò)程。




 

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